測定蛋白質(zhì)構(gòu)象方法(測定蛋白質(zhì)的構(gòu)型和功能要用什么儀器,步驟)
1.測定蛋白質(zhì)的構(gòu)型和功能要用什么儀器,有哪些步驟
你好，很高興回答你的問題。
構(gòu)型這個概念是指 一個有機分子中各個原子特有的固定的空間排列。這種排列不經(jīng)過共價鍵的斷裂和重新形成是不會改變的。構(gòu)型的改變往往使分子的光學(xué)活性發(fā)生變化。蛋白質(zhì)的構(gòu)型就是一級結(jié)構(gòu)，指其氨基酸排列順序。
測定蛋白質(zhì)的構(gòu)型的主要有兩種方法：Edman降解（Edman degradation）和質(zhì)譜法。
EDMAN降解法測序是經(jīng)典的方法，通過從多肽鏈游離的N末端（或者C末端，但是很少）測定氨基酸殘基的序列的過程。N末端氨基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然后從多肽鏈上切下修飾的殘基，現(xiàn)在一般都是自動測序儀。
質(zhì)譜法測蛋白只要是利用生物質(zhì)譜儀，比如ESI-Q-TOF,ESI-IT-Obitraq。利用特異的酶將蛋白切成肽段， 然后通過質(zhì)譜方法進行測定，產(chǎn)生數(shù)據(jù)或通過重頭比對，或者通過生物信息學(xué)中數(shù)據(jù)庫搜索的方法推斷出肽段序列，然后再由肽段序列拼接處蛋白序列。這種方法是近些年來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展而廣泛被使用，但是對于蛋白完整序列測定需要較強的生物信息學(xué)技術(shù)。
整體而言， EDMAN降解法準(zhǔn)確， 但是耗時長， 而且對于所測定的肽段要求很高， 不能太長， 不能太難修飾等等， 一般能測個20-50堿基不錯了。而質(zhì)譜法方法快速，但是準(zhǔn)確性比EDMAN降解法略差。
另外，樓主講的蛋白功能測定，不同的蛋白質(zhì)功能各異，蛋白功能主要通過生物學(xué)實驗反復(fù)驗證次得到，這個比較復(fù)雜，沒有固定的模式，要逐一研究。
另外，像核磁儀可以用來研究蛋白的構(gòu)象或者說晶體結(jié)構(gòu)，表面等離子共振儀器可以用來研究蛋白蛋白相互作用，等等，蛋白質(zhì)是未來有限的生物研究資源，現(xiàn)在全世界對蛋白質(zhì)的研究熱情都很高。也有許多相關(guān)的基礎(chǔ)科教書，樓主感興趣可以去看看。
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2.測量蛋白質(zhì)等電點的方法有哪些
等電點：如果調(diào)節(jié)溶液的PH值使得其中的氨基酸呈電中性，我們把這個PH值稱為氨基酸的等電點：PI。PI是氨基酸的重要常數(shù)之一，它的意義在于，物質(zhì)在PI處的溶解度最小，是分離純化物質(zhì)的重要手段。
等電點的計算：對于所有的R基團不解離的氨基酸而言（即解離只發(fā)生在α-羧基和α-氨基上），計算起來非常簡單：PI=(PK1'+PK2')/2若是碰到R基團也解離的，氨基酸就有了多級解離，這個公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aa Cys Asp Glu Lys His ArgPK'α-羧基 1.71 2.69 2.19 2.18 1.82 2.19PK'α-氨基 8.33 9.82 9.67 8.95 9.17 9.04PK'-R-基團 10.78(-SH) 3.86（β-COOH） 4.25（γ- COOH） 10.53（ε-NH2） 6（咪唑基） 12.48（胍基）在這種情況下可以按下面的步驟來計算：
<1>； 由PK'值判斷解離順序，總是PK1'< PK2'< PK3'<； …，即誰的PK'值小，誰就先解離。
<2>； 按照解離順序正確寫出解離方程式：簡式，注意解離基團的正確寫法。<3>； 找出呈電中性的物質(zhì)，其左右PK'值的平均值就是氨基酸的等電點：PI=(PK左'+PK右')/2以Lys為例：在黑板上用簡式演示
<3>；等電點的測定：等電聚焦法：這是一種特殊的電泳，其載體上鋪有連續(xù)的PH梯度的緩沖液，然后將氨基酸點樣，只要該處的PH與氨基酸的PI不同，則氨基酸就會帶電，PH值>PI時，aa帶-電；PH值<PI時，aa帶+電。通電后，氨基酸就會移動，直到某處的PH=PI，氨基酸才呈電中性，不再移動，因此，可以測出PI。等電點沉淀所有的氨基酸均為兩性物質(zhì)，亦即它們至少含有一個酸性基（carboxyl）及一個堿性基（α-amino）。
這些可游離的團基在pH變化時，因釋出或接受質(zhì)子而可充當(dāng)弱酸或弱堿，其離子化特性與其它物質(zhì)一樣遵守Henderson-Hasselbalch方程式：pH = pKa + log10 [未質(zhì)子化的形式（堿）] / [已質(zhì)子化的形式（酸）]即pH = pKa + log [A-] / [HA] 氨基酸可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）或雙極性離子（dipolar ion）及負(fù)電荷（anion）等三種，若在酸性溶液中帶正電荷，則在堿性溶液中帶負(fù)電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場中不移動時，稱此pH值為它的pI值（等電點）。因為凈電荷為零，凈電斥力不存在的緣故，大部份蛋白質(zhì)於等電點的pH值下，其溶解度最小。相反的，當(dāng)溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會凝結(jié)。所以，將pH調(diào)到等電點的大小，則大部份的蛋白質(zhì)將會沉淀，這種現(xiàn)象可以應(yīng)用於估算某蛋白質(zhì)的等電點.
3.測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 （一）實驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡?白質(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白 質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點是： （1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。
完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的 過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
4.=測定蛋白質(zhì)分子量的主要方法有哪些
知道蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成計算器 .cn/tools/mwcal/ 一般的方法： SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量 [原理] 十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， 簡稱SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在實驗基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新技術(shù)。
用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量具有快速靈便，設(shè)備簡單等優(yōu)點。 蛋白質(zhì)的電泳遷移率在一般的電泳方法中，主要取決于它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大?。捶肿恿浚┖托螤畹牟町愋?，而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對大多數(shù)蛋白質(zhì)，主要取決于它們的分子量，與原有的電荷量和形狀無關(guān)。
SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開蛋白質(zhì)氫鍵和疏水鍵，并按比例地結(jié)合到這些蛋白質(zhì)分子上形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，每克蛋白質(zhì)一般結(jié)合1.4克SDS。SDS與蛋白質(zhì)的定比結(jié)合使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物均帶上相同的負(fù)電荷，其量遠遠超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。
在水溶液中，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物具有相同的構(gòu)象，近似雪茄煙形的長橢園棒（短軸均為1.8nm，長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化），克服了蛋白質(zhì)間原有的形狀差異。這樣蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。
蛋白質(zhì)分子量與電泳遷移率間的關(guān)系可用下式表示：lgMr = K – bm 式中 Mr為分子量；K為常數(shù)；b為斜率；m為遷移率。 因此，用本法測定蛋白質(zhì)的分子量只需根據(jù)待測蛋白質(zhì)在已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的lgMr~遷移率的圖中的位置，就能得知分子量。
用本法測得的分子量，除單鏈蛋白質(zhì)外，均不是天然蛋白質(zhì)的完整分子量，而是組成這些蛋白質(zhì)的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構(gòu)象異常，或帶有大輔基的蛋白質(zhì)不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。
對一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等也不適用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照凝膠電泳系統(tǒng)中的緩沖液、pH值和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續(xù)系統(tǒng)電泳和 SDS-不連續(xù)系統(tǒng)電泳兩類；按照所制成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳兩類。
本實驗采用SDS-不連續(xù)垂直板型操作方法。通過實驗使學(xué)生掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板式電泳的原理及技術(shù)，包括制膠、灌膠、加樣、剝膠及固定染色等，學(xué)會用這些方法測定蛋白質(zhì)分子量。
[方法與步驟] 一、加樣液的制備 1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加樣液的制備 稱取細(xì)胞色素，胰凝乳蛋白酶原，胃蛋白酶，卵白蛋白，牛血清白蛋白各0.5~1mg，置小離心管（Eppendorf管）中，加入樣品溶解液1mL，充分溶解，如有不溶物應(yīng)離心除去。沸水浴熱處理3min，冷卻備用。
2、待測蛋白質(zhì)加樣液的制備 根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品存在的狀況而定。（1）固體 待測蛋白樣品，如為無鹽的純蛋白質(zhì)固體制劑，加樣液的制備方法同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加樣液的制備；如為含鹽的純蛋白質(zhì)固體制劑，應(yīng)先加水充分溶解，對透析緩沖液透析12~16h，然后吸取0.5mL（蛋白濃度應(yīng)為0.5~1mg/mL），置Eppendorf管中，并加入等體積濃樣品溶解液，沸水浴熱處理3min，冷卻備用。
（2）液體 待測蛋白樣品，如為無鹽的純蛋白質(zhì)液體制劑，則加入等體積濃樣品溶解液，然后熱處理；如為含鹽的液體制劑，則需先透析。二、凝膠的制備1、凝膠板的準(zhǔn)備 （1）洗板 將洗潔精用溫水稀釋后，用它浸透海綿擦洗玻板，然后用自來水洗凈，再用酒精將板擦干。
（2）安裝制膠板 制膠前將玻板與塑料嵌條和凹型陶瓷板的邊緣對齊，下沿用密封膠帶封口，用塑料夾子或鐵夾子將兩端夾好，注意要確保密封，安放在固定架上。2、分離膠和濃縮膠溶液的配制 組 分 分離膠/mL 濃縮膠/mL 凝膠貯備液 2.5 0.26 分離膠緩沖液（pH8.8） 1.9 — 濃縮膠緩沖液（pH6.8） — 0.510%SDS 0.075 0.02 TEMED 0.026 0.02 雙蒸水 3.05 1.2210%過硫酸銨 0.013 0.02 總體積 7.6 2 注意：①最后加入10%過硫酸銨溶液，混合制成凝膠液，迅速灌制凝膠。
②丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯酰胺凝膠無毒。
3、制分離膠 將制膠板垂直放好，插上與相應(yīng)厚度的樣品梳，在梳子下緣線1cm處做標(biāo)記，卸下樣品梳。將配好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，直至液面達到標(biāo)記處。
用滴管貼近膠液界面小心而又緩慢地覆蓋厚度約0.5cm的正丁醇層，以防止溶液蒸發(fā)并保證膠面平整。4、制濃縮膠 分離膠聚合后，倒去正丁醇，用蒸餾水沖洗分離膠膠面兩次，用濾紙吸去殘液。
用滴管將濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿制膠板，插入樣品梳。（三）電泳1、安裝電泳槽 濃縮膠聚合后，除去梳子、密封膠帶以及六個鐵夾。
將制膠扳、電泳糟內(nèi)芯、另一對制膠板依次放入槽內(nèi)。兩制膠板的凹型陶瓷板均應(yīng)與電泳槽內(nèi)芯接觸。
然后插入楔型板以固定兩套制膠板。如果每次電泳只用一塊膠板，必須用提供的有機玻璃板代替另一套制膠板。
2、加樣 在內(nèi)外水槽加注緩沖液，使內(nèi)外槽的水位均超過凹形板的缺口但低于。
