進行藥敏實驗方法(藥敏試驗的實驗步驟)
1.藥敏試驗的實驗步驟
去百度文庫，查看完整內(nèi)容>內(nèi)容來自用戶：Servicebio藥敏試驗操作方法藥敏試驗根據(jù)美國臨床標準委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，藥敏紙片選擇中國生物制品鑒定所藥敏紙片，試驗所選擇藥物必須包括下列抗生素：氨芐西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），諾氟沙星（NOR），四環(huán)素（TBT），利福平（RFA），復(fù)方新喏明（SMZ）。
1操作方法：（1）將待檢菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16~18小時，然后挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，懸于3ml生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調(diào)整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個M-H培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻。
（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。
每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。在菌接種后15分鐘內(nèi)貼完紙片。
（4）將平板反轉(zhuǎn)，孵育18~24小時后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄（附表5）。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。
有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標準。
是用與常規(guī)實驗相同的操作方法，測定質(zhì)控。
2.藥敏試驗的具體操作方法
1藥敏實驗操作步驟：在超潔凈工作臺內(nèi)，先將滅菌好的培養(yǎng)基做好標記，無菌取病料（即：肝臟、心臟組織）一小塊，輕輕在滅菌的培養(yǎng)基上涂布幾下（不要突破培養(yǎng)基），然后用接種環(huán)再密集劃線。然后，將制備好的藥敏片分別按標記好的位置貼在培養(yǎng)基的表面。記錄好培養(yǎng)皿的標記及藥敏片的順序。最后，將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)8—12小時即可。
2藥敏實驗結(jié)果觀察：培養(yǎng)好后會發(fā)現(xiàn)細菌再培養(yǎng)基上均勻分布，同時會看到藥敏片周圍有不同程度的抑菌圈。抑菌圈越大，說明該雞群對這種藥物越敏感；抑菌圈小或沒有抑菌圈，說明該雞群對這種藥物不敏感或已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性。若在培養(yǎng)皿中出現(xiàn)一團一團的細菌時說明培養(yǎng)皿中有雜菌感染。
3.藥敏試驗的實驗步驟
普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養(yǎng)基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基。做沙門氏菌可選擇血清培養(yǎng)基。
藥敏試紙：購買或自制（詳見實驗準備）
細菌：待做藥敏試驗的細菌
儀器：接種環(huán)、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭 2.1 藥敏片的準備：購買或自制
2.1.1 制備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。
2.1.2 抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。
2.2 藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。 3.1 藥敏片法
3.1.1 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個麥氏標準再涂布均勻。）
3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。
3.1.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。
3.2 牛津杯法
3.2.1 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.2.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，并在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時，觀察結(jié)果。
3.2.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。
3.3 打孔法：
該法較簡單，成本低，易操作，比較適用于商品藥物的檢測。
3.3.1 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.3.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。
3.3.3 加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。
3.3.4 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。
4.藥敏試驗常用的方法有哪些
具體如下：①半定量檢測方法：紙片擴散法，抑菌環(huán)直徑與MC的關(guān)系，根據(jù)折點評價 敏感性，是應(yīng)用最廣泛的藥敏測試方法；②定量檢測方法：瓊脂稀釋法、肉湯微量稀釋 法。
以最低抑菌濃度及折點評價藥物敏感性。是厭氧細菌藥敏測試常用方法；③Etest方 法：藥物按l02梯度遞減稀釋，放置于5x50 mm的塑料條上/塑料條上標記MC值，待測菌均勻涂于相應(yīng)培養(yǎng)基，含藥物的塑料條貼在涂好菌液的培養(yǎng)基上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi) 擴散以梯度遞減抑制微生物生長，待測菌被抑制的部位圍繞塑料條形成梨形抑菌環(huán)，以最低藥物濃度抑制真菌生長的藥物濃度為該抗真菌藥物的MC值。
E-test法綜合了瓊脂擴散法和稀釋法的原理，也集中了瓊脂擴散法和稀釋法的優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于需氧菌、厭氧菌 也包括絲狀真菌的藥敏測試。
5.請問藥敏試驗是通過怎樣的方法
藥敏試驗根據(jù)美國臨床標準委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，藥敏紙片選擇中國生物制品鑒定所藥敏紙片，試驗所選擇藥物必須包括下列抗生素：氨芐西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），環(huán)丙沙星（CIP），四環(huán)素（TBT），利福平（RFA），復(fù)方新諾明（SMZ）。藥敏結(jié)果判定標準按照NCCLs手冊2005版。
1. 操作方法：
(1)將待檢菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16~18小時，然后挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，懸于3ml生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調(diào)整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
(2)用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個M-H培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻。
(3)待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。在菌接種后15分鐘內(nèi)貼完紙片。
(4)將平板反轉(zhuǎn)，孵育18~24小時后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄（附表6）。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標準。
(5)每次藥敏試驗必須用ATCC 25922大腸桿菌做質(zhì)控。只有當質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株的結(jié)果才可以報告。ATCC 25922的結(jié)果必須與測試菌株同時記錄和報告在附表6中。
0.5麥氏比濁管配制方法：
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。
2. 注意事項：
(1) 制備MH瓊脂平板應(yīng)用直徑90mm平皿，在水平的實驗臺上傾注。瓊脂厚為4±0.5mm（約25-30ml培養(yǎng)基），瓊脂凝固后塑料包裝放4℃保存，在5日內(nèi)用完，使用前應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱烤干平皿表面水滴。傾注平皿前應(yīng)用pH計測pH值是否正確（pH應(yīng)為7.3）。pH過低會導致氨基糖苷類，大環(huán)內(nèi)酯類失效，而青霉素活力增強。
(2) 藥敏紙片長期儲存應(yīng)于-20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應(yīng)至于含干燥劑的密封容器內(nèi)。使用時從低溫取出后，放置平衡到室溫后才可打開，用完后應(yīng)立即將紙片放回冰箱內(nèi)的密封容器內(nèi)。 過期紙片不能使用， 應(yīng)棄去。
(3) 不穩(wěn)定藥物如亞胺培南， 頭孢克洛， 克拉維酸復(fù)合藥等， 應(yīng)冷凍保存， 最好在-40 ℃以下。
(4) 保證質(zhì)控菌株不變異的簡便方法，將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復(fù)活。然后每株細菌接種10支高層瓊脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，傳出細菌供常規(guī)用。待用剩至最后一支，可傳種在M-H平板上，再接種一批高層瓊脂管備用。如此可保證原始菌種永不接觸抗菌素。
3.質(zhì)量控制
質(zhì)量控制方法 是用與常規(guī)實驗相同的操作方法，測定質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)。應(yīng)使用新鮮傳代的菌種。接種菌液的涂布方法等均同常規(guī)操作，測定的抗菌素種類也應(yīng)與常規(guī)測定的種類相同。
6.細菌藥敏實驗的操作步驟
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藥敏試驗操作方法
藥敏試驗根據(jù)美國臨床標準委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，藥敏紙片選擇中國生物制品鑒定所藥敏紙片，試驗所選擇藥物必須包括下列抗生素：氨芐西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），諾氟沙星（NOR），四環(huán)素（TBT），利福平（RFA），復(fù)方新喏明（SMZ）。1操作方法：（1）將待檢菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16~18小時，然后挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，懸于3ml生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調(diào)整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個M-H培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻。（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。在菌接種后15分鐘內(nèi)貼完紙片。（4）將平板反轉(zhuǎn)，孵育18~24小時后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄（附表5）。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標準。是用與常規(guī)實驗相同的操作方法，測定質(zhì)控
7.細菌藥敏實驗的操作步驟
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1操作方法：（1）將待檢菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16~18小時，然后挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，懸于3ml生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調(diào)整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個M-H培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻。
（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。
每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。在菌接種后15分鐘內(nèi)貼完紙片。
（4）將平板反轉(zhuǎn)，孵育18~24小時后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄（附表5）。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。
有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標準。
是用與常規(guī)實驗相同的操作方法，測定質(zhì)控。
8.怎樣做藥敏試驗
一、紙片擴散法
該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，二抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關(guān)。
二、稀釋法
稀釋法藥敏試驗可用于定量測試抗菌藥物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌藥物的濃度通常經(jīng)過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌藥物的測試濃度范圍應(yīng)該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時也應(yīng)該包含質(zhì)控參考菌株的MIC. 2.1 瓊脂稀釋法 首先制備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株，然后是結(jié)果判讀。 2.2 肉湯稀釋法
三、抗生素濃度梯度法
四、自動化儀器法
