流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展(光子學(xué)在信息處理應(yīng)用中的進展)
流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展
流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展
流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展【1】
【摘要】 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是一種對單細(xì)胞快速定量分析的新技術(shù),能夠快速分析單個細(xì)胞的多種特性，其既可以定性也可以定量，適于大量樣品的檢測。
隨著流式細(xì)胞分析技術(shù)與方法的日臻完善和臨床應(yīng)用范圍不斷拓寬，幾乎臨床醫(yī)學(xué)各學(xué)科都涉及到流式細(xì)胞分析技術(shù)的應(yīng)用，已逐漸成為推動臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段,本文就流式細(xì)胞術(shù)在臨床上的應(yīng)用進展作一綜述。
【關(guān)鍵詞】流式細(xì)胞術(shù);臨床;進展
流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的對單細(xì)胞定量分析的一種新技術(shù)。
它借鑒了熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計算機技術(shù),具有極高的檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從單一細(xì)胞可以測得多個參數(shù),為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗提供了全新視角和強有力手段[1]。
目前,隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展,流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛使用在基礎(chǔ)研究和臨床實踐的各個方面,發(fā)揮著重要作用。
本文就其在臨床上的應(yīng)用綜述如下。
1 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用�
FCM可以進行淋巴細(xì)胞亞群分析,可同時檢測出一種或幾種淋巴細(xì)胞表面亞群分析,將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開來,并計算出它們相互間的比例。
通過對患者淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測定了解淋巴細(xì)胞的分化功能,鑒別新的淋巴細(xì)胞亞群。
更重要的是通過研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細(xì)胞亞群或某些細(xì)胞表面標(biāo)志的存在、缺乏、過度表達(dá)等,對一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監(jiān)測等有重要的臨床意義。
如HIV主要侵襲CD4+T細(xì)胞而導(dǎo)致CD4淋巴細(xì)胞減少,CD4/CD8淋巴細(xì)胞比值下降,為艾滋病的診斷和治療提供依據(jù)[2]。
在其它免疫功能性疾病的診治方面如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的淋巴細(xì)胞變化可反映該病的活動情況和器官侵犯程度,伴有嚴(yán)重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象[3]。
此外,FCM可以用來進行組織相容性抗原(HLA)群體分析;HLA-B27抗原陽性與強直性脊柱炎等一系列關(guān)節(jié)病有著不同程度的正相關(guān)。
FCM應(yīng)用HLA-B27特異性單抗檢測抗原，其敏感性較傳統(tǒng)的微量細(xì)胞毒性實驗大大提高,同時多參數(shù)的熒光測定使我們能夠在特定的細(xì)胞亞群中分析HLA-B27[4-5],還可以利用FCM進行移植配型移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測。
2 流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用�
血液系統(tǒng)腫瘤的診斷和治療 FCM通過對外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療起著舉足輕重的作用。
FCM采用各種抗血細(xì)胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個細(xì)胞的多種參數(shù)，以正確地判斷出該細(xì)胞的屬性。
各種血細(xì)胞系統(tǒng)都具有其獨特的抗原，當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時，免疫表型參數(shù)對各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準(zhǔn)確性可達(dá)到90%左右[5]。
微小殘留病變(MRD)是白血病復(fù)發(fā)的主要根源,FCM能在患者緩解期檢測是否有殘留病變細(xì)胞，及早發(fā)現(xiàn)后采取措施避免復(fù)發(fā)。
而且測定 DNA倍體和進行細(xì)胞周期分析對指導(dǎo)白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病細(xì)胞增殖狀況不同，定期了解細(xì)胞增殖情況采取相應(yīng)藥物可以提高療效。
急性白血病的多耐藥基因(MDR)也常用FCM檢測，F(xiàn)CM特有的敏感性和特異性，用于檢測二氨基苯茚酮 mRNA的表達(dá)產(chǎn)物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作為藥物的排出泵，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度)，可以更直接的反映耐藥程度。
陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種造血干細(xì)胞克隆病,細(xì)胞 CD55、CD59抗原表達(dá)減低是該病的一個特點。
FCM采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對血細(xì)胞 CD59的表達(dá)做定量分析，可以協(xié)助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴(yán)重程度。
網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指標(biāo)。
FCM通過某些熒光染料(吖啶橙等)與紅細(xì)胞中 RNA結(jié)合，定量測定網(wǎng)織紅細(xì)胞中 RNA，得到網(wǎng)織紅細(xì)胞占成熟紅細(xì)胞的百分比。
有報道認(rèn)為[6]FCM比目測法的精確度更高。
此外，F(xiàn)CM還可以測量出網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟度，對紅細(xì)胞增殖能力的判斷很有意義，為干細(xì)胞移植術(shù)后恢復(fù)的判斷、貧血的治療監(jiān)測、腫瘤患者放、化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據(jù)。
造血干/祖細(xì)胞計數(shù)造血干/祖細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化潛能，是各種血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的始祖。
造血干/祖細(xì)胞計數(shù)對造血干細(xì)胞移植意義重大。
CD34抗原是早期造血干/祖細(xì)胞的表面標(biāo)志，應(yīng)用 FCM分析、計數(shù) CD34 細(xì)胞已成為造血干/祖細(xì)胞移植、造血重建的重要指標(biāo)。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表達(dá)水平的高低來判斷,FCM測定血小板膜糖蛋白的表達(dá)情況可以診斷血小板膜糖蛋白異常所致疾病,這類疾病很少見但病因明確,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。
患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,導(dǎo)致血小板聚集功能明顯低下,這就是常染色體隱性遺傳病-血小板無力癥。
而巨血小板綜合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物數(shù)量或質(zhì)量的缺陷導(dǎo)致的遺傳性出血性疾病。
FCM還可以通過單抗免疫熒光標(biāo)記血小板膜糖蛋白監(jiān)測血小板功能及活化情況,評價活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)發(fā)生發(fā)展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療,此外血小板活化時細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度是活化血小板監(jiān)測的一項非免疫性指標(biāo),免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可產(chǎn)生血小板自身抗體,結(jié)合在血小板表面,稱為血小板相關(guān)抗體,檢測血小板表面或血清中的相關(guān)抗體,可用于該病的診斷及治療監(jiān)測[7]。
3 流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用�
FCM在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用主要是利用DNA含量測定進行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評估等工作,FCM可精確定量DNA含量,能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢做出判斷,有助于癌變的早期診斷[6]。
首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細(xì)胞懸液,用熒光染料(碘化吡啶P1)染色后對細(xì)胞的DNA含量進行分析,將不易區(qū)分的群體細(xì)胞分成三個亞群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài),非倍體細(xì)胞與腫瘤惡性程度有關(guān)。
DNA非整倍體細(xì)胞峰存在可為腫瘤診斷提供有力依據(jù)[6]。
腫瘤細(xì)胞DNA倍體分析對患者預(yù)后的判斷亦有重要作用。
異倍體腫瘤惡性病變的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率及死亡率均較高,而二倍體及近二倍體腫瘤的預(yù)后則較好。
FCM不僅可以對惡性腫瘤DNA含量進行分析,還可根據(jù)化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效,了解細(xì)胞動力學(xué)變化,對腫瘤化療具有重要的意義。
臨床醫(yī)師可以根據(jù)細(xì)胞周期各時相的分布情況,依據(jù)化療藥物對細(xì)胞動力學(xué)的干擾理論,設(shè)計最佳治療方案。
從DNA直方圖直接地看到腫瘤細(xì)胞的殺傷變化,及時選用有效的藥物對腫瘤細(xì)胞達(dá)到最大的殺傷效果。
4 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞凋亡和多藥耐藥基因中的應(yīng)用�
細(xì)胞凋亡是機體生長發(fā)育、細(xì)胞分化和病理狀態(tài)中細(xì)胞死亡的過程,凋亡典型的形態(tài)特征是核染色質(zhì)固縮并分離,細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞膜和核膜皺曲,核斷裂形成片斷,最后形成數(shù)量不等的凋亡小體。
FCM可以進行DNA含量分析,通過二倍體細(xì)胞G0/G1期峰前的亞二倍體峰來確定。
在凋亡早期,一些與膜通透性改變及凋亡有關(guān)的蛋白在細(xì)胞膜表面有特定表達(dá)。
通過FCM結(jié)合單克隆抗體可以檢測表達(dá)這些蛋白的細(xì)胞,從而確定細(xì)胞的凋亡情況。
多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白(P-gp)親脂化合物,包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。
從人淋巴細(xì)胞排除熒光染料與細(xì)胞內(nèi)P-gp的含量直接相關(guān)。
當(dāng)淋巴細(xì)胞出現(xiàn)MDR陽性細(xì)胞時,患者對化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性,需要考慮其它治療方式。
多藥耐藥是腫瘤患者化療失敗的主要原因,FCM對多藥耐藥基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達(dá)的測定,可為臨床治療效果分析提供有力依據(jù)[8]。
5 流式細(xì)胞術(shù)在器官移植中的應(yīng)用�
FCM在器官移植中占有重要地位,可被用來判斷供者與受者之間是否合適,用來鑒別和定型同種異體反應(yīng)抗體[6]。
通過供者白細(xì)胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在針對供者的循環(huán)抗體,就會同供者的淋巴細(xì)胞結(jié)合,再加入熒光素標(biāo)記的二抗來顯示這種結(jié)合,此方法能在移植手術(shù)前發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險的受體。
移植后免疫表型的監(jiān)測也很重要。
FCM可用于檢測移植后血液或移植內(nèi)免疫成分的變化,以預(yù)防移植后免疫�
排斥反應(yīng),細(xì)胞免疫抑制治療效果和移植存活情況,可敏感地預(yù)測排斥反應(yīng)的發(fā)生,為臨床治療提供有效依據(jù)。
6 流式細(xì)胞術(shù)在臨床細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用�
流式細(xì)胞術(shù)在臨床細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用具有快捷、靈敏,能同時進行多參數(shù)分析等優(yōu)點,可廣泛用于細(xì)菌、病原體、毒素和血清抗體及藥敏試驗。
免疫熒光檢測方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一個新應(yīng)用。
這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體的混合感染的檢測。
近年來,FCM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細(xì)菌的活力和功能狀態(tài),由于速度快,該方法已被建議作為臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗。
FCM藥敏檢測方法較多,通過測量加入藥物孵育后的散射光的DNA含量來判斷抗生素對細(xì)菌的敏感性。
該法現(xiàn)被認(rèn)為是FCM在該領(lǐng)域應(yīng)用的經(jīng)典方法[6]。
7 FCM在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用�
在細(xì)胞周期內(nèi),DNA含量隨時相發(fā)生周期性的變化,通過熒光探針對細(xì)胞進行相對DNA含量測定,可分析細(xì)胞周期各時相細(xì)胞的百分比,周期動力學(xué)參數(shù)以及DNA異倍體。
可利用與鈣離子特異結(jié)合的熒光染料和激發(fā)光譜或發(fā)射光譜是pH值依賴熒光染料進行細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定和細(xì)胞內(nèi)pH值測定[9]。
8 流式細(xì)胞術(shù)在優(yōu)生遺傳領(lǐng)域中的應(yīng)用�
流式細(xì)胞術(shù)可使含量極微的胎兒有核紅細(xì)胞得到富集,因為有核紅細(xì)胞含有胎兒的全部基因,并具有不影響多胎妊娠等優(yōu)點,結(jié)合FISH,PCR等技術(shù),使之具有應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的廣闊前景[10]。
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流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用【2】
摘要 目的：通過了解和討論，對流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用情況做出詳細(xì)分析。
方法：通過多次嚴(yán)謹(jǐn)性實驗并且真實詳細(xì)記錄每次實驗數(shù)據(jù)，進一步分析流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用效果和可行性。
結(jié)果：經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)分析，流式細(xì)胞術(shù)在檢驗HLA-B27抗原、淋巴細(xì)胞亞群、腫瘤標(biāo)志物、白血病免疫、臨床微生物等應(yīng)用中有著明顯的效果。
結(jié)論：流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗中可以得到很好的應(yīng)用。
關(guān)鍵詞 流式細(xì)胞術(shù);流式細(xì)胞儀;臨床檢驗;應(yīng)用
流式細(xì)胞術(shù)是一種生物學(xué)技術(shù)，用流式細(xì)胞儀(FACS)對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數(shù)和分選。
這種技術(shù)可以用來對流過光學(xué)或電子檢測器的一個個細(xì)胞進行連續(xù)的多種參數(shù)分析。
流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是對懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子，通過檢測標(biāo)記的熒光信號，實現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)。
FCM不但快速、靈敏而且還可以同時對多個參數(shù)進行分析，F(xiàn)CM在臨床微生物檢測中的作用受到越來越多人的關(guān)注。
FCM不但可以用來檢測受染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原，而且還可以對受染細(xì)胞表面的病毒抗原進行檢測。
由于FCM檢測的一般只是單個細(xì)胞，因此經(jīng)過FCM檢測的受染細(xì)胞只適用于支氣管灌洗液、血液、尿標(biāo)本以及一些經(jīng)酶消化過的組織細(xì)胞，同時由于FCM進行的是多參數(shù)分析。
所以FCM體外抗生素藥敏試驗的主要機制是，通過FCM檢測病原體和染料結(jié)合在一起后所發(fā)出的不同強度的熒光。
從而間接地反映出病原體的功能狀態(tài)以及活性，以達(dá)到幫助判斷病原體對抗生素的反應(yīng)性目的，其中用于研究抗菌效應(yīng)的熒光染料主要有2大類：其中用來標(biāo)記DNA和RNA的染料主要包括如溴化乙錠、碘化丙啶等;其次是用來反映代謝活性或結(jié)合蛋白的探針，其中包括異硫氰酸熒光素、膜電位敏感性染料等。
怎樣選擇這些物質(zhì)，與這種染料本身的發(fā)射特性有關(guān)，同時抗生素的作用機制也可能關(guān)系到這些物質(zhì)的選擇。
近年來FCM在細(xì)菌的藥敏效應(yīng)的研究領(lǐng)域已獲成功，將這些熒光染料和FCM聯(lián)合運用到一起，可以判斷其細(xì)菌活力與功能狀態(tài)，這種方法由于有速度快等優(yōu)勢，臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗中也應(yīng)用到這種方法。
方法
本實驗用到的細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)，這個技術(shù)要用的實驗細(xì)胞包括MCF7、293(T)、U20S等。
以U20S細(xì)胞為例，他們通常所用的操作方法：首先對細(xì)胞進行培養(yǎng)以及鋪板，轉(zhuǎn)染、細(xì)胞分板、上機樣本制備、加藥刺激、細(xì)胞收獲及處理、相關(guān)試劑配制等步驟。
其中在細(xì)胞培養(yǎng)時，以U20S細(xì)胞作為細(xì)胞株和材料，在這個過程我們要注意的是一瓶細(xì)胞總數(shù)一般情況下會達(dá)到1×107個。
在鋪板的過程首先要對細(xì)胞進行分化，然后才對細(xì)胞進行計數(shù)，計數(shù)時如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度很大，影響計數(shù)，就必須對細(xì)胞進行合適倍數(shù)的稀釋后才計數(shù)。
最后才能進行鋪板。
鋪板的過程是：首先在6cm培養(yǎng)皿按照每孔6×105個的數(shù)量加入細(xì)胞，然后將6cm培養(yǎng)皿沿水平面方向前后左右來回晃動，使細(xì)胞能夠均勻分布，晃動時要小心以防止培養(yǎng)液潑出，再將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱里生長。
將這些過程都完成后，然后可以用轉(zhuǎn)染色劑Lipofectamin2000進行轉(zhuǎn)染操作，其操作過程：首先在DEF-FN載體上構(gòu)建目的基因質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞密度為達(dá)到50%～60%時，再進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染12～16h后，再根據(jù)細(xì)胞密度按1：3進行分板，使分板后細(xì)胞密度30%左右。
除了以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒作為陽性對照外，我們還可以以藥物處理細(xì)胞作為陽性對照。
將細(xì)胞鋪板24h后，再加藥對其進行刺激，加藥培養(yǎng)24h后，然后就可以對細(xì)胞進行收獲處理了。
注意在這個過程中要分別對培養(yǎng)液進行收集，在每個6cm規(guī)格的板中加入1mL胰酶進行消化。
待消化完畢后，再向內(nèi)一一對應(yīng)地加入已收集的培養(yǎng)液來中和胰酶。
上述過程進行完之后，最少要放置4h，才能從將細(xì)胞樣本從冰箱里取出進行離心操作來收集細(xì)胞。
將1×PBS清洗2遍后，再加入100μL 1×PBS將兩者混勻，加入10μL PI(終濃度100μg/mL)，10μLRnase(終濃度50μg/mL)，置于37℃水浴鍋，避光處理30min。
這樣才算完成上機樣本制備。
在處理分選細(xì)胞樣本前，要對細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)，每個細(xì)胞樣本至少需要1個10cm規(guī)格的細(xì)胞板，去除培養(yǎng)液酶消化，在37℃條件下充分消化至細(xì)胞輕拍脫壁，再加入5mL培養(yǎng)液進行中和，以充分分散細(xì)胞，取100μL細(xì)胞上機，測定轉(zhuǎn)染效率，剩余細(xì)胞計數(shù)、離心，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率，分選模式，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，達(dá)到上樣速率1000～3000個/s。
結(jié)果
經(jīng)過實驗分析得出結(jié)果，將其用于病毒檢測具有以下優(yōu)點及可行性：可在單個細(xì)胞中同時獲得多個分析參數(shù);能定量檢出受染細(xì)胞，當(dāng)用不同熒光染料標(biāo)記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時，F(xiàn)CM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原，這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體混合感染的檢測。
討論
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞技術(shù)也取得了快速的發(fā)展，其臨床應(yīng)用越來越廣泛，在臨床工作中發(fā)揮著重要的作用。
流式細(xì)胞術(shù)已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經(jīng)從科學(xué)研究走人了臨床應(yīng)用階段，在我國臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里已有著廣泛的應(yīng)用。
可見流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗的應(yīng)用具有很好的發(fā)展前景和可靠性。
光子學(xué)在信息處理應(yīng)用中的進展
光子學(xué)在信息處理應(yīng)用中的進展
評述光子學(xué)在印刷、數(shù)據(jù)存儲、圖像處理、光計算和量子計算中的`應(yīng)用.
作 者：邱元武 QIU Yuanwu 作者單位：上海同濟大學(xué)物理系,上海,200092 刊 名：激光與光電子學(xué)進展 ISTIC PKU英文刊名：LASER & OPTOELECTRONICS PROGRESS 年，卷(期)：2005 42(3) 分類號： 關(guān)鍵詞：光子學(xué) 光子技術(shù)應(yīng)用 信息處理