檢驗蛋白質含量的方法方法(測定蛋白質含量的方法,其原理各是什么)
1.測定蛋白質含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質濃度 （一）實驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋 白質溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點是： （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質與染料結合后產生 的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。
完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的 過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。 （3）干擾物質少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
2.常用來測定蛋白質含量的方法有哪些
1、凱氏定氮法
凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。
由于蛋白質含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。
優(yōu)點：可用于所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果準確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。
缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應，把低價氮氧化并轉為氨鹽來測定，而不能把高價氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測出物質中所有價態(tài)的氮含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是一個用于鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個堿性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。
當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色?？赏ㄟ^比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。
優(yōu)點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。
缺點：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。
3、酚試劑法
取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質溶液，不加標準蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。
優(yōu)點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。
缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。
4、紫外吸收法
大多數蛋白質在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。
取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。
優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收。?
缺點：①測定蛋白質含量的準確度較差，專一性差；?②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。
5、考馬斯亮藍法
考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合后，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。
在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恒定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。
一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。
優(yōu)點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。
缺點：由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。
參考資料來源：百度百科-蛋白質測定
3.蛋白質的檢驗方法
蛋白質測定方法： 測定蛋白質的方法可分為兩大類： 一類是利用蛋白質的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質含量 ； 另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團 以及芳香基團等測定蛋白質含量。
（1） 凱氏定氮法： 是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物，故此法的結果稱為粗蛋白質含量。（是食品上蛋白質含量測定最常用的方法） （2） 雙縮脲法 （3） 染料結合法 （4） 酚試劑法：方法簡便快速，故多用于生產單位質量控制分析。
（5） 紫外分光光度法-近紅外光譜法。
4.蛋白質定量測定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法?？捡R斯亮藍法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時
8~10小時 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離） 用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；費時太長
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化
考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質變化
